使用 HLS-CATCH™ 和TELL-Seq™技术对大的靶向基因组区域进行准确、低成本的单倍体分型测序
单倍型分型、从头组装和结构变异的检测均需要长读长的序列信息。长读长测序技术可以提供这样的信息，但存在成本高、精度低和对DNA投入量要求高的问题。
Universal Sequencing Technology (UST) 已经开发了一种 TELL-Seq™文库制备技术，该技术可实现低成本、高准确度地在Universal Sequencing Technology (UST)开发了一种单管反应的转座酶关联长读长测序（TELL-SeqTM）文库制备技术，该技术可实现在Illumina测序仪上进行低成本、高准确度的linked-read测序。TELL-SeqTM文库通常只需要0.1ng的输入材料就能产生超过100Kb的关联序列。这些特点使得TELL-SeqTM技术可以对Sage公司的HLS-CATCHTM方法产生的靶向长片段进行测序，且十分具有优势 。在以下实验中，我们使用TELL-SeqTM和HLS-CATCHTM靶向富集的技术，展示了在人类BRCA2区域进行长片段单倍体分型检测上的巨大优势。
使用Sage HLS-CATCH™ 工作流程（工作流程示意图见图1）处理来自Genome in a bottle网站上的阿什肯纳兹（Ashkenazi）家族样本是来Genome in a Bottle（GIAB）联盟取自犹太人家庭三个人的培养细胞，分别为NA24385（来源于儿子）、NA24149（来源于父亲）、NA24143（来源于母亲）。使用SageHLS CATCH的实验方法从13号染色体中分离出长度为187.5kb的靶向片段，该片段包含整个BRAC2基因以及5’端和3’端区域（chr13:32,258,275-32,445,810），实验方法见图1。简单来说，就是在琼脂糖HLS试剂盒的样品孔中通过电泳提取100万个细胞的高分子量DNA。提取后，用Cas9-gRNA混合物消化DNA（在HLS盒中），在目标片段的边界处进行剪切。在Cas9处理后，目标片段通过自动电泳系统进行筛选分离和洗脱。使用Sage Hi-Bead磁性颗粒试剂盒（Sage Science）对洗脱的目标DNA进行浓缩，并清洗掉污染的SDS。然后用Q-PCR方法对BRCA2产物进行定量（Thermo Taqman assay）。HLS-CATCHTM技术从100万个细胞中产生了22万-40万个187kb的BRCA2靶向拷贝，将基因组DNA富集了200-400倍。靶向片段的总DNA量在3-7ng之间。
TELL-Seq™ 连接读数库的构建（示意图见图2）是用0.1ng到0.2ng的BRCA2富集CATCH产物（取决于富集程度），使用超低输入的“小基因组”版本进行的。TELL-Seq™ 文库在Illumina MiSeq仪器上进行测序，使用2x150bp PE对父亲的细胞（NA24149），以及母取0.1到0.2 ng富含BRAC2的CATCH产物（取决于富集程度），使用TELL-Seq技术中超低输入的“小基因组”方法来构建TELL-Seq linked-read文库（文库构建示意图见图2）。文库在Illumina MiSeq仪器上进行测序，对父亲的样本（NA24149）进行2x150bp双端测序，对母亲（NA24143）和儿子（NA24385）的样本进行2x71bp的双端测序。父亲样本的测序结果，总共获得了8.2M的序列，其中目标序列约为4%。母亲和儿子样本的测序结果，每个样本分别获得了11.4M和8.4M的序列，目标片段捕获率约为2.5%。测序数据被转换为10X Genomics兼容格式，并使用10X的Long Ranger软件包进行单倍体分型分析。
使用Loupe浏览器（10X Genomics）展示三个细胞系的突变信息，见图3。在三个样本所有的 TELL-Seq™ 数据集中，几乎整个187kb的CATCH目标区域都可以被定相。此外，尽管单倍型之间的突变信息显示格式有些不同，但从图中可以看出，来自母亲的单倍型2与儿子的单倍型1相同，而父亲的单倍型2与儿子的单倍型2相同。
将6个单倍型中的变体与已知的GIAB数据进行详细比较，证实了这种安排。在这将6个单倍型中的突变与已知的GIAB数据进行详细比较。在这些单倍型中，有177个点与hg38参考基因不同。除去所有单倍型共有的突变，有36个突变可以将本次实验中取自同一家庭、经过CATCH捕获、长约180kb的BRCA2基因的4条单倍型分类，如图4所示。在本次CATCH + TELL-Seq™实验中检测到的所有6个单倍型都与Genome in a bottle网站上犹太人家族的高质量基因组序列一致。
这些数据表明，使用Sage HLS-CATCH™ 定向大片段分离技术与超低投入的Universal Sequencing Technology (UST) 的TELL-Seq™文库制备技术相结合，为准确的长程基因组测序和特定位点的单倍型测定提供了一条强大而经济的途径，而不需要昂贵的全基因组这些数据表明，Sage HLS-CATCH™靶向捕获大片段DNA技术与超低投入量的UST TELL-Seq文库制备技术相结合，为精准长读长基因组测序和特定位点的单倍体分型提供了一个强大、价格低廉的检测方法，且该方法不需要昂贵的全基因组长读长测序。此外，Sage发现 HLS-CATCH技术目标回收率从100万细胞回收25%提高到仅使用10万细胞得率50%。由于 TELL-Seq可以用低至0.1ng投入量的DNA提供高质量的数据，CATCH + TELL-Seq的组合检测方法可能对投入量有限的临床样本研究非常有用，如分离的活检样本。
原文链接：https://sagescience.com/wp-content/uploads/2020/10/TELL-SEQ-BRCA2-App-Note3.pdf
致谢：
Chris Boles, Tom Chen, Peter Chang, Long Pham
Sage Science, Inc.
Universal Sequencing Technology Corporation